PENGANTAR
Anggrek hitam (Coelogyne pandurata Lindl.)
adalah anggrek alam endemik Kalimantan timur dengan karakteristik bunga
berukuran besar berwarna hijau dan bibir hitam (Cullen, 1992). Anggrek ini
banyak dicari untuk dibudidayakan karena bunganya yang indah dan berukuran
besar. Kendala yang dihadapi dalam penangkaran anggrek hitam ini adalah periode
berbunganya sangat pendek (cepat layu) dan bunga relatif sulit untuk
disilangkan atau dibastarkan (Arditti, 1992), Selain itu, perkecambahan in
vitro biji anggrek hitam juga relatif lambat dan lebih sulit dibandingkan
anggrek lainnya, sehingga diperlukan perlakuan-perlakuan khusus (Wirakusumah,
2009, komunikasi pribadi).
Dalam budidaya in vitro anggrek, beberapa
medium biasa digunakan antara lain adalah medium Knudson C (KC), Vacin and Went
(VW), dan Murashige and Skoog (MS). Untuk mendapatkan pertumbuhan yang terbaik
sering ditambahkan senyawa organik komplek seperti air kelapa ke dalam medium
berbagai medium in vitro anggrek (Arditti, 1993, Widiastoety dan
Syafril, 1993; Demasabu et al., 1998; Untari et al., 2006) Islam et
al. (1998) menggunakan medium New phalaenopsis (NP) untuk kultur kalus
anggrek Phalaenopsis. Semiarti et al. (2006) juga berhasil mendapatkan
pertumbuhan optimal kultur tunas anggrek Phalaenopsis maupun Vanda pada medium
NP,
sehingga diharapkan medium NP tersebut dapat digunakan secara luas tidak hanya pada
Phalaenopsis.
Selama perkembangan tanaman, proses pengaturan
pertumbuhan organ (tunas, akar, bunga) dikontrol oleh sistem aktivasi dan
inaktivasi gen penentu pembentukan organ tersebut (Howell, 1998). Untuk
inisiasi pembentukan tunas pada tanaman model Arabidopsis, gen KNAT1 merupakan
gen kunci yang menjadi faktor transkripsi penentu pembentukan tunas (Lincoln et
al., 1994). Pembentukan multitunas ini menunjukkan telah terjadi
peningkatan totipotensi sel-sel soma untuk dapat beregenerasi menjadi tanaman
lengkap, sehingga sangat menguntungkan untuk diaplikasikan dalam mikropropagasi
tanaman anggrek.
Dalam penelitian ini, modifikasi genetik tanaman
anggrek hitam dilakukan dengan menyisipkan gen KNAT1 yang dikontrol
dengan promotor konstitutif 35S dari virus Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)
ke dalam protocorm anggrek hitam dengan mediator Agrobacterium tumefaciens strain
LBA 4404.
BAHAN DAN CARA
KERJA
Bahan
tanaman dan kondisi kultur
Bahan tanaman yang digunakan berupa protokorm
(perkembangan embrio anggrek) C. pandurata Lindl. (yang diperoleh
dari Edward and Frans Orchids Nursery, Jawa Timur), umur 4 bulan. Protokorm
ditumbuhkan pada medium VW dengan penambahan kentang 150 mg/L, pisang 150 mg/L,
kelapa 150 mg/L, dan NAA 1ppm. Kultur diinkubasi dengan cahaya putih 1000 flux
secara kontinyu dan temperatur 25°C. Dari keempat medium yang digunakan, tampak
bahwa medium NP memberikan hasil pertumbuhan tercepat mencapai fase 5 dengan
menunjukkan pembentukan bulbus dibawah pangkal daun. Hal ini sesuai dengan
hasil kultur kalus yang dilaporkan oleh Islam et al. (1998), disebabkan
karena NP mengandung unsur nitrogen dan phosphor yang lebih tinggi dibandingkan
medium kultur anggrek lainnya. Hasil transformsi protokorm anggrek hitam dengan
p35SKNAT1 maupun dengan vector pGreen kosong menunjukkan hasil yang cukup
signifikan, yaitu 43.25% (15 dari 35 protokorm dapat tumbuh membentuk tunas
pada medium seleksi antibiotik Kanamisin), dan 32,96 % untuk vektor.
Transformasi
gen
Transformasi genetik plasmid 35S::KNAT1 dan vector pGreen
ke dalam genom
anggrek
hitam dilakukan dengan metode Semiarti et al. (2007) dengan modifikasi medium
tumbuh. Setelah prekultur pada medium CIM (Callus Induction Medium; VW+2.4D
1mg/L) selama tiga hari, protokorm direndam dalam kultur bakteri Agrobacterium
tumefaciens LBA4404 yang mebawa plasmid 35S::KNAT1 atau vector pGreen
selama 30 menit, kemudian dikeringkan selama 30 menit. Protokorm ditanam kembali
pada medium CIM selama 7 hari. Protokorm dicuci dengan medium ½ VW cair +
Cefotaxim 300mg/l untuk menekan pertumbuhan agrobakterium, kemudian dipindah dalam
medium SIM (Shoot Induction medium; 0.15μM NAA+ 5μM 2iP) yang ditambah dengan Kanamisin
100 mg/L untuk seleksi transforman. Protokorm yang lolos seleksi, dihitung
frekuensi transformasinya dengan menghitung jumlah protokorm yang tetap hidup
dibagi dengan jumlah total protokorm yang ditransformasi.
HASIL DAN
PEMBAHASAN
Karakter
morfologi
Anggrek hitam adalah anggrek epifit, simpodial, yang
dicirikan dengan pertumbuhan mendatar memiliki lebih dari satu sumbu batang.
Dari tiap ruas, terdapat bulbus semu (pseudobulb) dengan dua daun. Bunga
majemuk (5-7 kuntum per ibu tangkai bunga), terminal, sepal-petal berwarna
hijau pucat berkilauan dengan labellum berwarna hitam, ukuran diameter bunga
7-12 cm. Buah berbentuk oval berwarna hijau tua, panjang 6 cm. Bji masak
berukuran panjang 2-2.5 mm mengandung embrio yang berwarna putih kekuningan
(Gambar 1.) Penentuan medium terbaik dan stadium pertumbuhan tunas in vitro
Dalam kultur jaringan tumbuhan, medium kultur yang baik sangat menentukan hasil
yang akan diperoleh. Medium yang baik hendaknya tidak hanya dapat menunjang eksplan
tetapi juga dapat meningkatkan pertumbuhannya secara optimal. Berdasarkan
tahapan pertumbuhan protokorm membentuk tunas dan tanaman lengkap (plantlet)
ditentukan 5 tahap perkembangan dengan kriteria sebagai berikut: Fase 1. Protokorm
membentuk satu daun ukuran panjang daun; fase 2, tunas dengan 2 daun; fase 3,
tunas dengan 3 daun; fase 4, tunas degan 4 daun ke 3; fase 5, plantlet dengan 4
daun dan bulbus (Gambar 2). Berdasarkan kriteria tersebut, hasil pembandingan
beberapa medium untuk budidaya anggrek diantaranya (KC, VW, MS, dan NP)
menunjukkan bahwa medium NP adalah medium yang terbaik.
Kendala yang dihadapi
dalam penangkaran anggrek hitam ini adalah periode berbunganya sangat pendek
(cepat layu) dan bunga relatif sulit untuk disilangkan atau dibastarkan .
Adanya ekspresi gen
KNAT1 diharapkan dapat meningkatkan totipotensi tanaman anggrek hitam sehingga
dapat diperoleh klon tanaman anggrek hitam dalam jumlah besar dan seragam
seperti yang telah diperoleh dalam penelitian sebelumnya pada anggrek bulan Phalaenopsis
amabilis (Semiarti et al.,2007).
Untuk mendapatkan
pertumbuhan yang terbaik sering ditambahkan senyawa organik komplek seperti air
kelapa ke dalam medium berbagai medium in vitro anggrek .
KESIMPULAN
1.
Anggrek hitam adalah anggrek epifit ,
dari tiap ruas terdapat bulbus , Bunga majemuk (5-7 kuntum per ibu tangkai
bunga) , Buah berbentuk oval berwarna hijau tua, panjang 6 cm
2.
Kendala yang dihadapi adalah cepat layu
dan bunga sulit dibastarkan
3.
Adanya ekspresi gen KNAT1 diharapkan dapat
meningkatkan totipotensi tanaman anggrek hitam sehingga dapat diperoleh klon tanaman
anggrek hitam dalam jumlah besar .
4.
Untuk mendapatkan pertumbuhan yang
terbaik sering ditambahkan senyawa organik komplek
Tidak ada komentar:
Posting Komentar